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细胞培养污染是实验室中常见且棘手的问题，一旦发生，不但会影响细胞的生长和形态，还可能改变细胞功能、性质，导致实验研究结果失真甚至前功尽弃。面对污染，细胞只能全部扔掉吗？哪些污染还有挽救的可能？实验室又该如何正确应对？本期细胞学堂将从污染识别、应急处理和预防措施三个方面，讲解细胞污染后应该如何应对。
发现细胞异常后，首先要判断污染类型，再决定是抢救还是弃用。
01细菌污染
细菌污染是最常见的污染类型，通常从污染发生到明显爆发仅需1-3d。
典型表现
培养基快速浑浊；
培养基颜色明显改变（通常变黄，因细菌产酸导致PH降低，使酚红指示剂变黄）；
显微镜下可见快速移动的杆状、球状颗粒或者不移动的密密麻麻的黑点。
02真菌（霉菌、酵母菌）污染
真菌污染发展相对较慢，通常需要一周左右才出现明显症状。
典型表现
霉菌污染：早期培养基保持澄清透亮不浑浊，不易察觉。随着污染加重，霉菌形成肉眼可见的绒毛状、菌丝状或絮状菌落；
酵母菌污染：显微镜下呈单个卵圆形或球形颗粒，可能会出芽形成更小的颗粒。
03支原体污染
支原体污染是细胞培养中最隐蔽的一类污染，普通光学显微镜下通常无法直接观察到，需通过支原体检测确认。
典型表现
培养基不浑浊，无异味；
细胞的形态变差、贴壁能力下降；
细胞增殖速度变慢，甚至漂浮死亡；
细胞间隙会出现明显的黑点。
04黑胶虫污染
黑胶虫污染是一种颇具争议的污染类型，目前黑胶虫是什么尚无明确定义。
典型表现
培养基不浑浊，保持澄清；
细胞周围出现很多黑点和细胞碎片；
细胞状态变差，增殖变慢；
更换培养基后黑点仍持续存在，并可随传代继续扩散。
05交叉污染
虽然细胞间的交叉污染不像其它微生物污染比较常见，但却是细胞培养中明确存在且后果严重的问题之一。由于肉眼或显微镜难以准确判断，一般需通过STR鉴定进行进一步确认。
典型表现
细胞形态与既往特征不符;
功能实验结果出现明显偏差;
培养基通常无浑浊现象。
发现污染后应立即隔离受污染的细胞，停止共用培养基、血清、PBS、胰酶、枪头等试剂耗材，避免污染进一步扩散。
1、分类处理
根据污染类型采取相应措施：
轻度细菌污染可尝试用10×双抗或者双抗原液润洗两遍细胞并持续观察。重度细菌污染建议消杀后直接丢弃。
真菌污染较难根chu，且真菌孢子易飘散在空气中污染实验室环境，一旦出现真菌污染不建议保留，建议直接消杀后丢弃。
支原体、黑胶虫污染后若细胞状态尚可，可添加支原体清除试剂、“黑胶虫"清除试剂培养2-3代观察细胞状态；若细胞污染后状态很差，建议消杀后丢弃。
交叉污染应立即停止使用该细胞系，对于已经污染的细胞系，应全部丢弃，并重新从原始来源或可靠的细胞库获取新的细胞株。
2、排查污染来源
污染通常来源于操作、试剂和耗材三个环节，应逐一排查：
操作因素：检查近期无菌操作是否规范，例如培养基瓶口是否长时间敞开？操作过程中衣袖或手臂是否越过开放容器？超净台使用前是否提前灭菌？实验人员的衣着是否规范？使用移液器过程中枪头是否触碰过非无菌表面等。
试剂因素：将当前使用的培养基及其他试剂（如血清、PBS、胰酶等）取适量分别放在干净的器皿里，并置于37℃培养箱中静置培养2-3 d，观察是否出现浑浊、沉淀或颜色异常的情况，并在显微镜下检查是否存在微生物污染，以评估试剂是否受到污染及是否可继续使用。
耗材因素：检查培养瓶、离心管、枪头等耗材包装是否完好、是否在有效期内，并确认使用前已完成无菌处理。
3、环境消杀
确认污染源后，应及时对相关区域进行彻di消毒。
使用75%的酒精擦拭操作台、生物安全柜及仪器设备表面。
采用甲醛（40%）10 mL/m2，高锰酸jia5 g/m2，熏蒸细胞实验室。
所有接触过污染细胞的培养瓶、移液管、枪头等，须经高压蒸汽灭菌后再丢弃至医疗废物桶，避免造成二次扩散。
相比污染后的补救措施，规范的日常管理才是控制细胞污染zui有效的方法。
01规范人员管理
进入实验室必须穿隔离衣、戴口罩等防护用品。
尽量减少人员频繁出入细胞实验室。
加强实验人员培训，规范无菌操作流程。
02加强环境管理
每天上班操作前和下班后，均需对细胞间进行紫外消毒；每隔一段时间需对实验室的整体环境进行熏蒸。
培养箱需定期消毒灭菌。
无菌操作台使用前需打开紫外灯消毒至少30 min，实验后需用75%的酒精擦拭台面并打开紫外灯照射30min。
可使用普诺赛®细胞房安全卫士和水浴锅安全卫士等商品化产品进行日常污染预防。
实验废弃物需进行高压蒸汽灭菌后，再丢弃至医疗废物桶。
03严格执行细胞实验室规章制度
不断完shan无菌实验室的规章制度，加强无菌实验室的管理规范。外来进修人员、实习学生等进入实验室前要进行相关的细胞操作培训和教育，掌握bi备的基本理论、实验技能、操作规范，在带教老师的指导下进行实验操作。
细胞污染是养细胞路上绕不开的坑，不要看到污染就全盘放弃，也不要抱着侥幸心理硬救。精准识别污染类型，科学应急处置，把预防做在前面，才能远离污染翻车，不让你的努力白白消耗！
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