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细胞学堂 | 大鼠骨髓间充质干细胞的分离提取

更新时间:2024-02-19  |  点击率:556




骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)来源于中胚层,是具有多分化潜能的细胞。细胞生物学表明,BMSCs具有较强的增殖能力和多向分化潜能。在不同诱导条件下,可向中胚层细胞如脂肪细胞、成骨细胞、肌细胞等分化。BMSCs 是理想的种子细胞来源之一,在细胞替代治疗、基因治疗及组织器官再造中具有重要的临床应用价值。





本期细胞学堂为大家整理了大鼠骨髓间充质干细胞分离提取的方法、注意事项及鉴定指标,帮助您快速上手开展实验。







分离提取步骤

骨髓取材

将大鼠断颈处死后, 置于75%医用酒精内浸泡5~10 min,消毒后将动物转运至超净工作台内。无菌分离双侧股骨和胫骨,用新的剪刀镊子清除股骨胫骨周围肌肉组织;保持骨头完整,留取纯净骨头,将组织转移至新的含有PBS的培养皿内,剪去骨干的两端, 暴露骨髓腔;取注射器,吸取培养基,从骨头一端插针,冲洗骨髓(至骨头发白透亮),反复吹打制成单细胞悬液。




分离方法


BMSCs常见的分离方法有密度梯度离心法贴壁法以及免疫磁珠分选法,大家可以根据自己实验室条件来选择合适的分离方法。


1

密度梯度离心法


将装有大鼠骨髓液的15 mL离心管,1500 rpm离心5 min;弃上清,用完-全培养基重悬沉淀;将培养基重悬的细胞悬液缓慢滴加到Percoll分离液(用PBS稀释)上方,形成密度梯度分离液;2000~2500 rpm离心25 min,吸取中间层的白色雾状细胞层,加入PBS清洗细胞,1800 rpm离心5 min;弃上清,保留细胞沉淀;用细胞完-全培养基重悬沉淀,将细胞悬液按1×106/mL密度接种于T25瓶中,于37℃,5%CO2恒温培养箱中静置培养。首-次2 d换液,弃去未贴壁细胞, 此后每2~3 d换液一次;待细胞融合达80%后, 用胰酶消化1~2 min后传代培养。


2

贴壁法


也称全骨髓培养法或一步法。将收集的骨髓悬液经200目筛网过滤后,用完-全培养基制成单细胞悬液;培养48 h首-次换液,弃去未贴壁细胞;此后每2~3 d换液一次,观察细胞的生长及融合程度,待细胞融合80%以上后开始传代培养。


3

流式细胞仪或免疫磁珠分选法


免疫磁珠法和流式细胞仪分选法通过识别细胞表面特异性抗原分离细胞,可获得纯度较高的细胞,但对细胞的活性影响较大,获得的细胞量少,需要特殊的仪器,实际应用受限。





注意事项

取材严格无菌操作。除基本的无菌要求外, 在剪取大鼠的双下肢及剥离皮毛后,应更换取材器械,避免取材和分离骨髓间的交叉污染;

培养基营养要充足。血清浓度可摸索调整,培养时可额外添加生长因子;

采用密度梯度离心法时, Percoll分离液最好是现配现用。此外,分离液和细胞悬液的比例应合适,一般采用 1∶1;

注意细胞接种密度、换液时间。密度过低会影响细胞贴壁、融合。不同的操作方法中换液、传代时间各异,根据细胞生长状况及时调整换液、传代时间。







鉴定指标

01

细胞形态学观察

刚分离提纯的原代细胞形态呈圆形,大小不一,漂浮于培养液中(图1)。经纯化贴壁后可见,细胞呈成纤维样紧密排列,漩涡样生长,胞核大、清晰、呈长梭形,细胞形态趋于统一(图2),其形态符合BMSCs 的贴壁形态。

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图1 大鼠骨髓间充质干细胞刚分离,呈圆形


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图2 普诺赛实验室提纯的大鼠骨髓间充质干细胞


02

表面标志物

目前使用较多的是CD90、CD29、CD44等阳性表达指标。

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普诺赛实验室提取的大鼠骨髓间充质干细胞CD90表达




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