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疑难解析 | 2023年度直播答疑热点汇总

更新时间:2024-01-16  |  点击率:254


细胞培养过程中,我们通常会遇到各种各样的问题,这些问题一般是多种因素造成的,如细胞密度、培养环境、操作方法等。2023年,普诺赛围绕细胞培养问题,共举办了10场线上直播,吸引了万余人观看。直播期间,大家踊跃发言,提出了日常实验中遇到的问题。本期直播答疑筛选出部分问题做了详细解答。


牙源性干细胞培养时,血清会诱导分化吗?

血清成份复杂,里面包含抑制分化的因子,也包含促进分化的因子;间充质干细胞一类成体干细胞大多可以用血清培养,单能干细胞,用血清不会分化;胚胎干会细胞分化。

血清的刺激分化主要与血清品质相关,品质高的可以维持干细胞增殖,抑制分化;品质较低的如新生牛血清会诱导分化;与生产批次也有关系,不同批次因子含量不一,分化效果不一。

▪ 筛选品质高的血清批次;

▪ 添加抑制分化的因子,如bFGF,EGF等;

▪ 及时传代,控制密度,刺激增殖,高密度会引起分化;

▪ 及时换液,防止代谢累积,刺激分化;

▪ 控制培养基质量如内毒素、支原体、pH等等,控制环境稳定。

LX2细胞培养有哪些需要注意的点?

细胞密度高的时候,消化3~4 min 才能完-全消化下来,细胞高密度下生长速度快,低密度下细胞增殖慢甚至死亡,建议传代比例控制在1:2~1:4,不要超过1:4。

镜下观察,已经开始生长分化的细胞漂浮

很多是什么原因?

细胞分化了之后是不会再增殖的。细胞分化实验前期,细胞还能缓慢增殖,但随着实验的进展,漂浮的细胞越来越多,这时候要分不同的情况处理:

▪ 如果实验前,细胞长得过满,可能因为接触抑制产生较多漂浮细胞。这种情况下,只要贴壁的细胞没有受到影响,实验可以继续;

▪ 另一种情况,是实验开始时的密度合适,实验开始后,贴壁的细胞慢慢脱落漂浮,这种情况是不正常的,需要结合实验前细胞状态、实验所用的诱导试剂对细胞的影响等多方面的因素去调整。

NK-92细胞有些脏,怎么梯度离心呢?

正常培养的细胞系是没有梯度离心这个概念的,梯度离心通常是用于细胞提取时,多种细胞混合在一起的一种分离措施。悬浮细胞培养的过程中会始终伴随着细胞的死亡,细胞死亡后裂解就会产生碎片。这种可以通过低速离心(800 rpm,3~5 min)去除一部分,但无法完-全去除。

细胞的密度怎么判断?

悬浮细胞需要计数来判断。贴壁细胞可以看不同视野下细胞的密度,以大多数视野下的密度为准。需要注意的是,不是所有细胞都会平铺单层,有些细胞可能会堆叠生长,比如Hep G2。

THP-1细胞贴壁了,是怎么回事呢?

THP-1是一类单核细胞,可以在特定的情况下分化为M0型的巨噬细胞,这时的细胞就是会贴壁的。培养的过程中如果发现细胞出现了贴壁的情况,传代的时候可以只收集漂浮的细胞。同时排查实验室的环境、培养基、血清等,看看有没有什么特定的影响因素导致细胞贴壁。

NK-92越养活力越低,怎么办?

细胞培养传代次数多了,会存在状态越来越差的情况。可以在细胞状态好的时候,一边传代,一边冻存。NK-92细胞有很强的IL-2依赖性,培养时要注意避免过度吹打,团块吹散的同时,细胞也容易受损。培养过程中,一方面需要注意及时添加IL-2,一方面也需要注意吹打次数,一般轻轻吹2~3下将大团吹成小团就可以了。

贴壁细胞,会有一些亮晶晶像油一样的东

西,这是污染了吗?

需要结合具体的细胞及图片具体分析。如果是一些有成脂能力的细胞,不排除是细胞培养的过程中受到某种刺激分化形成了脂滴。除此以外,还需要排除器皿本身的影响。最后结合显微镜下的图片及视频进行判断,看是否有明显微生物的痕迹。如果上述方法都无法判断,必要时,可以收集细胞培养液置于37℃培养箱进行空培养,观察是否有明显的微生物增殖。

为什么复苏后细胞就老化了?

细胞复苏后老化,可能是因为细胞冻存前的状态不佳,以及冻存时的保存活性效果不好,这些都会影响细胞状态,其中冻存损伤影响比较常见。建议控制冻存前状态、控制冻存过程及冻存液确保细胞活率。

诱导成脂肪细胞,只看形态吗?需要其他

方法进行鉴定吗?

一般诱导效果好,脂滴大,相差显微镜白光可以观察到油滴,可能会存在误判,建议使用标准检测方法,用油红O染色方法鉴定。

悬浮细胞怎么进行脂质体转染?

悬浮细胞通常是当天按实验所需细胞量接种细胞,后续配置转染复合物,将转染复合物滴加到培养基中,根据摸索好的转染时间,收样检测。

DNA和siRNA共转染如何操作?

设置好分组,空白对照、阴性对照、阳性对照、DNA、siRNA、DNA和siRNA共转染(用无血清培养基稀释DNA和siRN及DNA,无血清培养基稀释转染试剂),摸索适宜的浓度、比例、转染时间。

悬浮细胞培养,易成团,如何尽量减少成

团?

大多数悬浮细胞培养时都会聚团,还有些悬浮细胞本身就是聚团长的,不聚团说明细胞活性较差,如NK-92细胞。培养本身是聚团生长的悬浮细胞,是不可以减少细胞团的。如果是存在少数聚团,大部分单颗悬浮的细胞,可以将细胞进行高密度培养.一般密度在200万/mL时,细胞大部分是单颗分散的。

NCI-929细胞复苏后很难养,细胞不增殖,

怎么办?

这是一株对营养要求较高的悬浮细胞,培养的时候需要添加β-巯基乙醇。如果细胞刚复苏就生长缓慢,可以先用台盼蓝染色检测细胞的活性。如果是复苏时生长状态较好,但传代后生长缓慢,可能是培养基的营养不够,比如没有加β-巯基乙醇等。另外,细胞不增殖可能与接种时的密度太低有关。悬浮细胞培养是有密度要求的,一般情况下密度控制在50-200万/mL为佳,密度太低了,细胞增殖缓慢,密度太高了,细胞可能会慢慢裂解死亡。