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鸡卵泡颗粒细胞分离、培养实验步骤

发表时间:2022-04-07  |  点击率:315
  鸡卵泡颗粒细胞分离、培养实验步骤:
 
  A. 翅下静脉注射2mL EDTA-2Na(W/V,2%)溶液处死母鸡,新洁尔灭消毒液浸泡消毒5min,打开腹腔,剪取整个卵巢,小心剥离卵泡(以8-15g为最佳),置于装有PBS缓冲液的无菌培养皿中;
 
  B. 用加有双抗的PBS缓冲液冲去血污,漂洗3次;将漂洗干净的卵泡移入装有预冷PBS缓冲液的平皿中,剥净卵泡外膜、结缔组织及血管网;
 
  C. 用手术刀在卵泡表面划一道1-2cm长的切口(动作要快),释放卵黄,用PBS缓冲液将剩余的卵黄液漂洗干净,剩下的卵泡膜即为:基膜和卵泡颗粒细胞层;
 
  D. 将漂洗干净的卵泡膜尽量剪碎,置于15mL离心管中,加4mL培养基,用1mL移液枪反复吹打1min,自然沉降5min,收集上清液备用;
 
  E. 向离心管内加入4mL 0.2%Ⅱ型胶原酶,重悬沉淀,置于37℃恒温水浴锅中消化30min,每5min震荡一次;
 
  F. 消化结束,加入4mL M199完全培养基(含10%血清)终止消化;用200目不锈钢筛过滤,收集滤液,1200rpm离心5min;
 
  G. 沉淀用M199洗2次,室温离心,1200rpm,5min;弃上清,加入M199完全培养基(含5%FBS及1%双抗)重悬后接种于6孔塑料培养皿,置于37℃、5%CO2培养箱内静置培养;12-24h后换液,随后每天观察,2-3天换液一次,待鸡卵泡颗粒细胞生长融合用于实验。