细胞共培养体系怎么选？直接、间接、3D共培养实验设计要点全解析

在生命科学与临床医学研究中，传统单一的细胞培养已越来越难以满足复杂微环境的研究需求。为了更真实地模拟体内细胞间相互作用，共培养技术逐渐成为研究细胞互作与微环境调控的重要工具。

本期细胞学堂将盘点常见共培养体系及实验关键点，帮助您快速选择适合自身实验需求的方案。

一、什么是细胞共培养？

细胞共培养，是指将两种或两种以上类型的细胞，在同一实验体系中共同培养，以模拟体内细胞间相互作用的一类技术。

细胞共培养的概念由来已久。早在1911年，研究人员便在鸡胚胎组织的体外培养中观察到不同组织之间细胞的迁移与相互作用。20世纪70年代，研究人员初次尝试利用小鼠成纤维细胞系（3T3）作为饲养层细胞，与人原代表皮细胞共培养，这也成为现代细胞共培养体系的雏形。

随着肿瘤微环境、干细胞、免疫治疗及类器官等研究的快速发展，传统的单一细胞培养已越来越难以准确模拟体内复杂的细胞互作环境。相比单一细胞培养，共培养体系能够更真实地再现细胞间的物理接触、旁分泌调控及微环境信号传递，因此被广泛应用于肿瘤研究、组织工程、药物筛选及再生医学等领域。

二、常见共培养体系及特点

细胞共培养根据细胞间是否直接接触以及培养空间结构的不同，分为多种类型（表1）。

表1. 常见共培养体系及分类方式

1、直接共培养

直接共培养是指两种或多种细胞在同一培养体系内共同生长并发生直接接触。细胞可通过表面受体结合、间隙连接及旁分泌因子等途径实现信息交换，形成物理接触与化学信号的双重作用模式[1]。

直接共培养尤其适用于免疫突触形成、细胞黏附及受体激活等研究。 但由于不同类型细胞混合生长，实验后细胞分离及信号溯源的难度也会相应增加。

根据培养方式不同，直接共培养包括以下两种方式：

●混合共培养

将两种或多种细胞直接混合培养，使细胞间充分接触。例如，将NK-92细胞和K-562细胞混合共培养，可用于研究免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用[2]；

●饲养层共培养

利用支持性细胞为目标细胞提供生长所需的微环境。例如，以间充质基质细胞（MSCs）作为饲养层，与CD34+的造血干细胞/祖细胞（HSPCs）共培养，可用于研究基质细胞对造血干细胞/祖细胞活性的调控作用[3]。

2、间接共培养

间接共培养通过物理间隔阻止细胞间直接接触，但允许分泌的细胞因子、外泌体、代谢产物等穿过屏障进行信息交换。

与直接共培养相比，间接共培养实验可控性更高，更易区分信号来源，因此更适用于细胞间旁分泌作用及分子机制研究。

常见的细胞间接共培养包括Transwell系统和条件培养基培养。

●Transwell系统

通常由上下两个培养室组成，中间以特定孔径的半透膜隔开。上下室分别接种不同的细胞，两种细胞不能直接接触，但可通过分泌物穿过半透膜实现信号传递。

例如，在构建血脑屏障（BBB）模型时，可将脑微血管周细胞和星形胶质细胞混合接种于小室膜的下底面，待细胞汇合度达到90%后，再将脑微血管内皮细胞接种至膜的上底面[4]，以此模拟血脑屏障的多细胞微环境。

●条件培养基培养

先单独培养A细胞，收集含有A细胞分泌物的培养基上清，并将其作为条件培养基用于培养B细胞，从而研究A细胞分泌的可溶性因子对B细胞的功能状态的影响。

例如，收集NIH/3T3细胞培养24 h后的上清液作为条件培养基，单独培养肠神经胶质细胞，以研究NIH/3T3细胞分泌的因子对肠神经胶质细胞神经元分化的影响[5]。

3、3D共培养

3D共培养是指在三维（3D）空间实现多细胞协同培养，以构建更接近生理状态的组织样结构。相比2D共培养，3D共培养能更有效维持细胞极性、分化功能及组织特异性。

3D共培养主要技术形式包括以下两种：

●无支架体系

通过悬浮液滴或低吸附培养器皿，诱导细胞自组装形成球状体。以肿瘤球模型为例，细胞经富集培养形成克隆球体，培养过程中细胞分泌的物质形成细胞外基质。

●有支架体系

主要包括水凝胶和固体支架两种方式。

水凝胶包埋：基于细胞外基质（ECM）的各种天然成分构建，常用单一成分材料（如胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸、明胶、海藻酸盐等），也可选用由多种蛋白质及相关分子复合而成的基质胶（Matrigel）。

固体支架：包括纤维状支架、多孔支架等，多采用成分明确的合成材料。相对天然材料，合成材料具有更好的机械性能 ，且不存在生物降解带来的未知影响。

此外，近年来快速发展的微流控技术进一步推动了3D共培养向动态微环境精准模拟方向发展。基于微流控芯片的3D细胞共培养技术被广泛用于构建器官芯片，可模拟人体内各器官的生理过程并构建疾病模型，在病理研究和药物开发中具有重大价值。

三、共培养三大易忽视关键点

1、共培养方式选择

需根据实验目的和需求，综合评估各方面因素，选择合适的共培养方式。

直接共培养适用于细胞间接触依赖的研究（如免疫突触形成、细胞黏附），但需考虑实验后细胞分离的可行性。

间接共培养适合分析信号分子来源和功能，实验重复性高，但无法模拟细胞间物理接触的作用。

3D共培养可以模拟更真实复杂的人体环境，在肿瘤球和类器官构建、肿瘤微环境、组织修复等研究中具有明显优势[6]。但技术复杂度高，需优化支架材料和培养条件。

2、共培养培养基优化

细胞共培养体系需平衡不同细胞的生长需求，同时避免培养基本身对实验结果产生干扰和影响。

预实验筛选：在预实验阶段，可分别尝试各细胞对应的培养基，或者将相关细胞的培养基按照等比例混合[4]，根据细胞生长情况选择最合适的方案。

定制化培养基：针对特定共培养体系，可根据不同细胞对基础培养基、血清、生长因子等的需求，定制专用共培养的培养基[1,2,5]。

3、细胞接种密度和比例优化

细胞接种密度会直接影响细胞间接触程度及信号传递效率。适当提高细胞密度有助于增强细胞互作，但过高密度可能导致接触抑制，反而影响细胞状态及信号交流。

此外，不同细胞接种比例也会显著影响细胞间的相互作用。

因此，正式实验前需通过预实验优化细胞接种密度和比例，摸索优的条件[1]。比如，在NK-92细胞对K-562细胞的杀伤实验中，按照20:1、10:1、5:1和2.5:1设置效应细胞和靶细胞的比例，逐步摸索优条件[2]。

以上就是本次细胞共培养实验关键要点。从培养原理、常见培养体系及特点到培养易忽视的关键点，帮助你轻松设计实验方案。

持续关注普诺赛®细胞学堂，更多硬核干货等你来看！

参考文献

1. Vis, M. A. M. Microenvironmental advancement and miniaturization of human in vitro bone models. Eindhoven University of Technology.2023. 150p.

2. Freitas Monteiro M, Papaserafeim M, Andreani M, et al. NK Cytotoxicity Mediated by NK-92 Cell Lines Expressing Combinations of Two Allelic Variants for FCGR3. Antibodies (Basel). 2024 Jul 12; 13 (3):55.

3. Sinha S, Chakraborty S, Sengupta A. Establishment of a Long-Term Co-culture Assay for Mesenchymal Stromal Cells and Hematopoietic Stem/Progenitors. STAR Protoc. 2020 Nov 24;1 (3): 100161.

4. Lu Z, Ren S, Wang B, et al. Intranasally administered muse cells attenuate neurodegeneration in Parkinson's disease. J Transl Med. 2025 Dec 24; 23 (1): 1421.

5. Veríssimo CP, Carvalho JDS, da Silva FJM, et al. Laminin and Environmental Cues Act in the Inhibition of the Neuronal Differentiation of Enteric Glia in vitro. Front Neurosci. 2019 Sep 3; 13:914.

6. Xu J, Pham MD, Corbo V, et al. Advancing pancreatic cancer research and therapeutics: the transformative role of organoid technology. Exp Mol Med. 2025 Feb; 57 (1): 50-58.