细胞爬片是一种将细胞培养在玻璃或塑料表面上,使其附着并扩展的技术。一般是让玻片浸在细胞培养基内,使细胞在玻片上生长。这种技术可以用于观察细胞形态、运动、细胞与细胞之间相互作用等。利用细胞爬片进行体外实验可排除体内诸多干扰因素的影响,方便对细胞进行各种干预处理。
我们在做免疫荧光(IF)、原位杂交(FISH)、凋亡检测(TUNEL)等实验时,都需要制备细胞爬片,而爬片质量会影响到最后的图片呈现效果以及实验数据的精准性。本期细胞学堂为大家整理了细胞爬片的制作步骤及注意事项,帮助您快速上手开展实验。
操作步骤
01
爬片准备
1
根据实验选择合适大小的爬片。
2
爬片处理,首先浸酸:5%稀盐酸浸泡过夜(最好逐片浸入,多片同时浸入会引起多片粘连、浸洗不充分),第二天先用自来水冲洗20次,再用三蒸水冲洗2次(清除残留酸液)。
3
将爬片置于无水乙醇浸泡过夜(浸洗脂类污渍),75%乙醇长期保存备用(无需高压灭菌)。使用时镊子取出爬片,酒精灯烘烤,放入孔板。
02
细胞爬片
1
收集贴壁细胞进行计数,按照实验需求用完-全培养基稀释细胞至合适浓度。
2
加细胞前,先在每个孔里准备放爬片的位置滴加少量培养基(目的是使爬片与培养皿靠液体的张力粘合到一起),然后轻放爬片(注意不要产生气泡,防止加细胞悬液时爬片漂起)。整个过程注意无菌操作。
3
根据实验需求接种合适细胞量到培养器皿内。
03
爬片的固定
固定液的选择:
以多聚甲醛为例进行固定:
1
准备4%多聚甲醛(PFA),于4℃冰箱中保存,使用时常温复温。
2
在培养板中将已爬好细胞的爬片用PBS浸洗3次,每次3 min,轻轻晃动,避免将细胞冲掉。
3
用4%的多聚甲醛固定爬片15 min(细胞自带荧光时注意避光),PBS浸洗爬片3次,每次3 min。
4
Triton X-100(PBS配制,浓度根据实验调整)室温通透20 min。
5
PBS浸洗爬片3次,每次3 min。
6
按实验需求进行后续实验。
04
细胞爬片封片
封片前根据实验需求决定是否需要孵育抗体或复染核。孵育好后用PBS浸洗3次,用吸水纸吸干爬片上的液体,封片液封片。
注意事项
注:各个实验室的操作流程都各有差异。此方案是我们实践验证可行的方案。