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细胞学堂 | 微血管内皮细胞知识盘点

更新时间:2023-10-23  |  点击率:1103


微血管内皮细胞(microvascular endothelial cells,MVECs)构成了血液与组织液之间的物理屏障,而且在机体的凝血与抗凝血、致炎与抗炎及免疫应答等方面起着十分重要的作用,其体外培养模型广泛应用于相关研究。但由于不同组织器官的微血管内皮细胞之间存在较大的异质性,同时微血管内皮细胞因解剖部位不同,在形态学、表型和功能上等方面也存在明显异质性,不同来源的血管内皮细胞之间是不可相互替代的,主要包括肠、肺、心脏、脑、脉络膜、视网膜、真皮微血管内皮细胞等。





本期细胞学堂为大家整理了微血管内皮细胞的提取、培养和鉴定方法及步骤,帮助您快速上手开展实验。





提取方法




微血管内皮细胞的提取和培养有酶消化培养法、组织块培养法、免疫磁珠法。





酶消化培养法

采用消化酶将对应组织内细胞间质如基质、胶原蛋白、纤维蛋白等解离,使细胞分散,形成单细胞悬液后再接种进行培养的方法。

主要包括:实验动物及日龄的选择(根据取材部位决定动物日龄)→对应部位的取材→组织的剪碎及清洗→加酶消化→离心去酶→计数后接种培养→细胞纯化→细胞鉴定;



组织块培养法

是将从体内取出的组织剪切成一定大小的组织块后,接种于培养瓶进行的培养。

主要包括:试验动物及日龄的选择(根据取材部位决定动物日龄)→对应部位的取材→组织的剪切→接种培养。



免疫磁珠法

通过在磁珠表面包被具免疫反应性的抗体进行抗原抗体反应,筛选或去除所标记的细胞,达到阳性或阴性选择细胞的目的。

主要包括:实验动物及日龄的选择(根据取材部位决定动物日龄)→对应部位的取材→组织的剪碎及清洗→加酶消化→离心去酶→加入磁珠与细胞孵育→磁珠磁力架分选→收集沉淀技计数→接种培养。




大鼠肺微血管内皮细胞提取示意图


大鼠肺微血管内皮细胞提取示意图[1]





各种提取方法的优劣势

酶消化

培养法

可以在短时间内得到大量细胞,但是操作繁琐,易污染,纯化步骤多,需要使用昂贵的胶原酶,导致成本偏高,并且酶浓度和消化时间需要摸索;

组织块

培养法

成功率较高,成本低,适合于组织量少的原代培养,但是细胞迁出时间不好把握且组织块去除不彻-底会造成其它杂细胞污染;

免疫

磁珠法

得到的细胞纯度高,但是成本高,需要较多的细胞以备筛选和纯化。







注意事项


1

试验动物的日龄和健康状态可能会影响目的细胞的活性、代次;

2

取材部位的分离需要尽可能多的剔除多余组织以及保证无菌;

3

得到大小适中、容易贴壁的组织块是分离细胞的关键;

4

采用吹打法时,吹打管的规格、吹打的次数会直接影响细胞贴壁能力和细胞的纯度;

5

虽然各种酶的消化活力有一定的组织特异性,但由于任一组织器官均不是由单一的组织细胞成分构成,因此酶消化液常根据所分离培养细胞的种类等因素进行筛选;

6

采用酶消化法时,消化时间和温度的控制也特别重要。消化时间过长、温度过高不利于细胞的贴壁和伸展;消化时间过短、温度过低则达不到组织分离的目的;

7

建议使用内皮细胞专用培养基,培养基含有内皮细胞培养所需的微量元素、生长因子等;

8

建议包被处理(比如PLL、明胶等),促进内皮细胞贴壁,形态立体;

9

对于大部分细胞来说,同一种细胞,大鼠类的细胞代次会比小鼠细胞代次略高;


10

随着传代的增加,细胞的形态会发生变化。






鉴定指标





显微镜观察鉴定


可以初步观察细胞形态和生长规律,细胞呈鹅卵石典型的铺路石样、多角形、梭形,细胞核大而清晰;



贴块法获取的肺微血管内皮,呈铺路石样

贴块法获取的肺微血管内皮,呈铺路石样



贴块法获取微血管内皮细胞后进行消化转瓶,消化转瓶或者传代后细胞形态有变化

贴块法获取微血管内皮细胞后进行消化转瓶,消化转瓶或者传代后细胞形态有变化





大鼠脑微血管内皮细胞提取过程[2]

大鼠脑微血管内皮细胞提取过程[2]



特异性标志


目前使用较多的是FactorⅧ、 vWF、和CD31的阳性表达。




参考文献

[1]白祥慧,邹登朗,祁得胜,等. 大鼠肺微血管内皮细胞培养方法研究进展[J].畜牧兽医科学,2021.

[2]张帆. 单筛过滤法体外分离培养原代大鼠脑微血管内皮细胞及其鉴定[J].中国组织化学与细胞化学杂志,2023.

[3]段佳熙,巨噬细胞外泌体介导慢阻肺微血管内皮细胞凋亡及其机制研究[D].中南大学,2022.

[4]免疫磁珠法分离培养小鼠原代骨骼肌微血管内皮细胞及鉴定[J].心脏杂志,2023.

[5]Wong E,Nguyen N,Hellman J.Isolation of primary mouse lung endothelial cells[J].J Vis Exp,2021,(177):e63625.

[6]Sokol L,Geldhof  V,Garcia-Caballero M,et al.Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues:Small intestine,colon,heart,and liver[J].STAR Protoc,2021,2(2):100489.