欢迎来到武汉普诺赛生命科技有限公司网站!
咨询热线

400-999-2100

当前位置:首页  >  技术文章  >  细胞学堂 | 如何解决bEnd.3细胞形态变化、难消化

细胞学堂 | 如何解决bEnd.3细胞形态变化、难消化

更新时间:2023-05-23  |  点击率:538

bEnd.3 [BEND3] (小鼠脑微血管内皮细胞)是从来自患有内皮瘤的小鼠脑组织中分离的内皮细胞,该细胞通过表达多瘤病毒中间T抗原的NTKmT逆转录病毒载体感染而转化。在培养时,bEnd.3细胞最常遇到的问题就是细胞形态变化和难消化,本期细胞学堂将帮您逐一解决。




细胞形态问题




bEnd.3细胞本身生长较慢,在低密度时会呈现不规则细胞形态,高密度时则呈规则纤维状,所以若在培养过程中发现细胞形态异常,则有可能是细胞密度低,建议细胞铺满密度较高时传代。以下为bEnd.3细胞不同密度培养图片:


图片

低密度(100倍镜)


图片

中密度(100倍镜)


图片

高密度(100倍镜)





消化问题




消化时间

bEnd.3细胞培养时间越长越难消化,培养4天传代,一般消化3-5分钟;培养7天传代,一般消化5-10分钟。具体消化时间以显微镜下观察细胞状态为准。


图片

培养7天,消化5分钟显微图


图片

培养7天,消化10分钟显微图




难消化问题

如遇到消化困难不必担心,可通过分次消化的方式解决,具体操作方法如下(以T25瓶细胞为例):

01

吸出原培养液;

02

加入2mL左右PBS,轻轻晃动培养瓶润洗细胞,吸出PBS丢弃;

03

加入1mL左右胰酶,轻轻晃动培养瓶使之浸润所有细胞;

04

放入培养箱消化,消化3-5分钟(根据具体细胞稍作延长或缩短),显微镜下看到细胞开始漂浮,可以加入2mLPBS,晃动培养瓶使细胞悬浮,不要吹打剩下的贴壁细胞;

05

吸出培养瓶内的PBS和细胞悬液,转移到无菌离心管中,在离心管中加入3mL含血清的培养基终止消化并吹散细胞,使细胞尽量呈单颗细胞的悬浮液;

06

原培养瓶中加入0.5mL胰酶,晃动培养瓶浸润细胞,放入培养箱继续消化,直到细胞块中间全部收缩变圆,晃动培养瓶可脱落;

07

用3mL含血清的培养基终止消化,将瓶底的细胞全部吹下,并轻轻吹吸分散细胞呈单颗;

08

收集细胞悬液与第一次消化下来的细胞合并到一个离心管;

09

离心收集细胞沉淀,1200rpm/min 3分钟,离心完吸出上清丢弃;

10

加入新鲜培养基,吹打几下混匀细胞,按需接种到新培养瓶,补足培养基,拧松瓶盖或使用透气瓶盖进行培养;

11

检查培养箱二氧化碳,温度和水盘。





培养小贴士





01

图片


细胞培养过程中形态多样,低密度时容易出现放射状细胞,看似已经铺满瓶底,其实细胞量较少,需要细胞胞体排列紧密的时候进行传代;

02

图片


细胞培养过程中避免频繁换液,可以每隔2-3天换液或者半量换液一次;

03

图片


培养过程中会产生10%左右活的单颗漂浮细胞,贴壁细胞密度偏低时,注意收集悬浮细胞,贴壁细胞密度偏高时,可以换液时丢弃;

04

图片


接种量对细胞生长有影响,接种量过低细胞会有增殖缓慢,漂浮过多的现象,请注意控制传代比例;

05

图片


细胞对温度和pH较敏感,传代或换液前培养基可以常温复温4小时以上;避免使用pH改变(偏酸:颜色偏黄;偏碱:颜色偏紫红)的培养基;

06

图片


细胞传代过程中若出现单次消化时间过长,可进行分次消化,切不可将细胞强行吹下来,以避免吹打造成细胞机械损伤。