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细胞学堂 | 贴壁细胞6大培养难题原因和解决方法

更新时间:2023-03-24  |  点击率:913

贴壁细胞在培养时要贴附于培养(瓶)器皿壁上,细胞一经贴壁就迅速铺展,然后开始有丝分裂,并很快进入对数生长期。

贴壁细胞因其培养过程较为繁琐,所以培养时更容易出现问题。以下总结了贴壁细胞培养中常见的6种问题,并详细介绍原因和解决方法,若培养时遇到这些情况,可参考对应解决方法处理。


01


传代后细胞全部飘起


解决方法:检查所使用的培养基的颜色是否偏紫色(如图1),检查瓶盖是否透气,不透气瓶盖是否被拧松。


图片

图1. 培养基颜色偏紫


通常培养基偏碱,颜色就会偏紫,主要是因为培养基里的酚红指示剂遇酸变黄、遇碱变紫,培养基量太少,或培养基存放时间太长时都会变碱。建议配好完-全培养基后分装到50mL离心管并于一周内用完,量少时放到15mL离心管里保存



02


传代后部分细胞漂浮


原因及解决方法如下

1

传代前细胞密度太大:一般细胞汇合度达到80%时可进行传代操作,传代密度需适中,传代密度过高也会导致传代后漂浮;


2

细胞状态不好:可通过提高血清比例、稳定培养环境等方法进行改善;


3

吹打次数过多造成机械损伤:轻柔吹打,细胞呈单颗粒时可停止吹打,吹打过程避免气泡产生;


4

培养基更换后不适应:更换回原来的培养基;或者与原培养基比例混合后使用,使细胞有个适应期。



03


传代后细胞变形


原因及解决方法如下

1)变形,但细胞还在生长:可能是血清批次不一样导致,血清成分复杂,不同批次和品牌间均存在成分差异,影响细胞状态。建议使用同一批次血清,更换血清时需与原血清比例混合后使用,使细胞有过渡期;

2)变形,但细胞不长,且碎片增多:可能传代操作过程损伤,常见于消化不当,或者潜在支原体等污染导致细胞病态;消化时间根据每个细胞的状态来调整,消化过度或者消化不充分均会对细胞造成影响;培养过程应严格无菌操作,实验环境尽量洁净,确保细胞无外源污染。




04


细胞生长周期变慢,边养边漂


原因及解决方法如下

细胞传代时密度太稀或太密:建议细胞密度达80%左右进行传代,传代密度适中,密度过低会延长生长周期;

传代操作不当:根据细胞特性决定细胞消化时间,一般在显微镜下观察细胞回缩变圆并有少量细胞脱落即可终止消化,难消化的细胞可分次消化,每次时间不超过5min;频繁换液或者清洗细胞也会导致细胞状态变差,常规换液时间间隔为2~3天。



05


传代后细胞成团


解决方法如下

1

低密度接种,延长换液时间,防止细胞脱落;


2

使用多聚赖氨酸包被培养器皿,以增加细胞贴壁牢固度,降低细胞聚集成团的几率;


3

重新铺板,并更换新配制的培养基,加大血清比例(增加比例不超过5%);


4

接种时,减少培养基量(如T25加3mL)以加快细胞贴壁速度,等待细胞贴壁后(约8-12小时),再补加培养基到正常用量。



06


细胞出现空泡


原因及解决方法如下

1)正常的细胞活动:有的细胞有正常的自噬行为或其他膜泡活动,无需特殊处理(如Caco-2细胞);

2)血清不适应、培养基成分改变、换液不及时等造成细胞营养不良:可通过更换更合适的血清或及时换液等方法解决;

3)机械损伤、PH偏高或偏低等造成细胞受损:注意培养条件及操作手法。